摘要：

當(dāng)前mRNA脂質(zhì)納米粒(LNP)疫苗的一個(gè)缺點(diǎn)是它們必須在（超）di溫下儲(chǔ)存，了解這些疫苗不穩(wěn)性的根本有助于我們合理提高mRNA-LNP產(chǎn)品的穩(wěn)定性，從而降低對(duì)儲(chǔ)存溫度的要求。在這篇綜述中，我們討論了mRNA-LNP可能的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、影響mRNA-LNP穩(wěn)定性的因素以及優(yōu)化mRNA-LNP產(chǎn)品穩(wěn)定性的策略。對(duì)mRNA-LNP結(jié)構(gòu)的分析表明，mRNA、可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)和水存在于LNP中，中性輔助脂質(zhì)主要位于包裹的外壁。mRNA水解是mRNA-LNP不穩(wěn)定的主要因素。目前尚不清楚LNP中的水如何與mRNA相互作用，以及mRNA的易降解位點(diǎn)通過(guò)與可離子化的陽(yáng)離子脂質(zhì)的結(jié)合而受到多大程度地保護(hù)。為了提高mRNA-LNP疫苗的穩(wěn)定性，首先，應(yīng)優(yōu)化mRNA的核苷酸組成。其次，更好地了解mRNA在LNP中所處的環(huán)境可能有助于合理調(diào)整LNP結(jié)構(gòu)以保持mRNA的完整性。此外，干燥技術(shù)如凍干，可能是仍有待探索的可行途徑。

1、背景介紹

當(dāng)下正在開(kāi)發(fā)的許多疫苗中，有兩款疫苗已在預(yù)防感中顯示出高效保護(hù)率，這兩款疫苗代著新一代疫苗產(chǎn)品：它們由脂質(zhì)納米粒包裹信使核糖核酸鏈（mRNA）。BioNTech/Pfizer和Moderna開(kāi)發(fā)的這些mRNA疫苗的保護(hù)效力約為95%，并且是首批獲得FDA“緊急使用授權(quán)”和EMA “條件批準(zhǔn)”的mRNA疫苗。疫苗mRNA編碼SARS-CoV-2病毒的刺突(S)糖蛋白，其中包括兩個(gè)脯氨酸替換（K986P和V987P突變），以穩(wěn)定糖蛋白的融合前構(gòu)象。在肌肉 (IM) 注射給藥后，LNP系統(tǒng)使宿主細(xì)胞能夠攝取并遞送mRNA 到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中mRNA序列在核糖體中翻譯成S蛋白。在宿主細(xì)胞進(jìn)行翻譯后加工后，S蛋白在細(xì)胞表面以其融合前構(gòu)象作為膜結(jié)合抗原被呈遞，為B細(xì)胞提供抗原靶標(biāo)。此外，部分翻譯表達(dá)的S蛋白進(jìn)入抗原呈遞途徑，通過(guò)T細(xì)胞表位的組織相容性復(fù)合體（MHC）呈遞提供T細(xì)胞的抗原識(shí)別。EMA評(píng)估報(bào)告將mRNA疫苗在注射部位的作用機(jī)制認(rèn)定如下：“注射LNP包裹的mRNA疫苗會(huì)導(dǎo)致短暫的局部炎癥，從而促使中性粒細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)募集到注射部位，招募的APC能夠攝取 LNP納米粒繼而表達(dá)S蛋白，隨后可以遷移到發(fā)生T細(xì)胞的局部淋巴結(jié)”，由于這種固有的先天免疫，沒(méi)有必要用額外的佐劑配制mRNA疫苗。有趣的是，輝瑞/BioNTech和Moderna專(zhuān)門(mén)使用修飾后的核糖核苷酸來(lái)構(gòu)建mRNA，以降低（而不是提高）mRNA固有的免疫原性，強(qiáng)調(diào)需要適當(dāng)平衡mRNA疫苗的先天免疫活性（下文詳細(xì)討論）。體內(nèi)抗原表達(dá)可以通過(guò)疫苗給藥后來(lái)實(shí)現(xiàn)，與mRNA疫苗的自佐劑特性相配合，終產(chǎn)生有效地中和抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫，從而為疫苗接受者降低感的風(fēng)險(xiǎn)。

與其他類(lèi)型的疫苗相比，mRNA疫苗有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗的一個(gè)普遍優(yōu)勢(shì)是它們的開(kāi)發(fā)相對(duì)較快，因?yàn)閙RNA-LNP是一種平臺(tái)技術(shù)。在鑒定保護(hù)性蛋白抗原并對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行測(cè)序后，可在數(shù)周內(nèi)制備mRNA。由于編碼不同抗原的mRNA在化學(xué)和物理上高度相似，新mRNA疫苗的配方設(shè)計(jì)和制造過(guò)程遵循相同的步驟。與有復(fù)制缺陷的病毒型載體相比，mRNA疫苗可能有更高的病毒保護(hù)效力。與基于病毒載體的疫苗不同，機(jī)體不會(huì)對(duì)載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在這方面，mRNA疫苗類(lèi)似于基于脫氧核糖核酸(DNA)的疫苗。然而，DNA疫苗仍有極小的機(jī)會(huì)進(jìn)行潛在的基因組整合。此外，與mRNA疫苗相比，DNA疫苗在早期臨床試驗(yàn)中顯示出相當(dāng)?shù)偷拿庖咴?，這可能是因?yàn)榛贒NA的疫苗需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用，從而使有效遞送變得復(fù)雜?？傮w而言，靈活的設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)流程和相對(duì)較短的細(xì)胞質(zhì)存在時(shí)間使mRNA疫苗非常有優(yōu)勢(shì)，尤其是在病毒快速變異的大流行背景下。

然而，在開(kāi)發(fā) mRNA疫苗時(shí)遇到的挑戰(zhàn)之一是它們的穩(wěn)定性差。目前，大多數(shù)mRNA疫苗是通過(guò)肌肉注射給藥的，在注射部位被宿主細(xì)胞攝取mRNA繼而表達(dá)出抗原。mRNA疫苗的早期研究表明，裸露的mRNA在給藥后會(huì)迅速降解。因此，在過(guò)去很多年，人們一直在努力改善體內(nèi)給藥后mRNA的穩(wěn)定性，一種方法是通過(guò)優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)的方法來(lái)減緩其降解。另一種成功且目前廣使用的方法是用LNP將mRNA包封，從而保護(hù) LNP中的mRNA。這減少了給藥后mRNA過(guò)早的降解，并增強(qiáng)了向抗原呈遞細(xì)胞胞內(nèi)遞送的能力。

盡管目前在提高mRNA-LNP疫苗的體內(nèi)穩(wěn)定性和功效方面取得了進(jìn)展，但對(duì)其儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性仍然關(guān)注較少。為了疫苗能有效地在全球范圍內(nèi)進(jìn)行流通，mRNA-LNP疫苗能夠在冷藏溫度（2-8°C）或更高的溫度下有足夠長(zhǎng)的有效期。目前，公開(kāi)資料中幾乎沒(méi)有關(guān)于mRNA-LNP制劑長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。此外，尚不清楚在LNP中包封的mRNA會(huì)在多大程度上改善mRNA疫苗的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。關(guān)于LNP包封mRNA的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、LNP組分的化學(xué)穩(wěn)定性和mRNA-LNP系統(tǒng)的膠體穩(wěn)定性也知之甚少。現(xiàn)在已知的是，為了更長(zhǎng)時(shí)間地儲(chǔ)存當(dāng)前的mRNA疫苗，它們必須被冷凍。目前Moderna和BioNTech/輝瑞的疫苗分別需要在-15~-25℃和-60~-90℃儲(chǔ)存，但迄今為止，這兩家公司mRNA疫苗產(chǎn)品的降解過(guò)程和儲(chǔ)存溫度要求不同的原因尚不完全清楚。

將mRNA-LNP需要冷凍儲(chǔ)存阻礙了疫苗的流通。尤其是，需要儲(chǔ)存在-60~-90 °C的極低溫，對(duì)疫苗在全球運(yùn)輸、儲(chǔ)存和流通是個(gè)極大的挑戰(zhàn)。大多數(shù)其他疫苗可以在2–8 °C下儲(chǔ)存。顯然，當(dāng)前迫切需要研發(fā)出性質(zhì)更加穩(wěn)定不需要冷凍儲(chǔ)存的mRNA-LNP疫苗。本綜述概述了使mRNA疫苗更穩(wěn)定的方法，以便它們可以在不太極端的溫度下儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間。為了探討該主題，討論了mRNA-LNP疫苗的特性及其對(duì)儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響，以確定mRNA疫苗不穩(wěn)定的原因并探索提高其穩(wěn)定性的方法。

mRNA疫苗概述

mRNA-LNP 疫苗的組成是其穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。在針對(duì)****的疫苗開(kāi)發(fā)過(guò)程中，已經(jīng)有多種不同的 mRNA 候選疫苗。目前，有10種不同的針對(duì)**的mRNA疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，包括常規(guī) mRNA疫苗和自擴(kuò)增 mRNA (SAM)。目前有三種“常規(guī)”可編碼完整的S蛋白的mRNA 疫苗已獲批或處于臨床試驗(yàn)后期。它們是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV（可見(jiàn)表1）。

有幾篇綜述對(duì)這三種**的 mRNA疫苗進(jìn)行了詳細(xì)比較，包括它們?cè)?mRNA 結(jié)構(gòu)和LNP設(shè)計(jì)方面的差異和相似之處。以下部分旨在概述這些疫苗中mRNA 成分和 LNP遞送系統(tǒng)的功能和特征，因?yàn)樗鼈儗?duì) mRNA 疫苗的體內(nèi)給藥和儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。

表1  有關(guān)目前上市使用或臨床 III 期試驗(yàn)的三種 mRNA-LNP疫苗的信息，出于比較原因，添加了 Onpattro（一種 siRNA-LNP 藥物產(chǎn)品）的藥物產(chǎn)品信息。

* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂質(zhì)復(fù)合物注射液；藥品質(zhì)量審查附錄（FDA，2017 年）。

a N = 可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)（氮），P = 核苷酸（磷酸鹽）。

b推測(cè)

2.1 優(yōu)化mRNA體內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯能力的mRNA工程

mRNA由于其磷酸基團(tuán)上帶有負(fù)電荷，在生理 pH 范圍內(nèi)是以聚陰離子大分子的形式存在。遞送mRNA 疫苗的**個(gè)障礙是由于核糖核酸酶在細(xì)胞外環(huán)境中含量豐富，裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次， mRNA進(jìn)入細(xì)胞會(huì)被細(xì)胞內(nèi)RNA受體識(shí)別，包括內(nèi)體Toll 樣受體 (TLR) 和細(xì)胞質(zhì)核酸受體。mRNA與這些宿主防御受體的結(jié)合會(huì)**先天免疫通路，會(huì)導(dǎo)致數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)。一方面，這可以為疫苗提供佐劑樣作用。另一方面，它導(dǎo)致細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)，這強(qiáng)烈降低了細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯表達(dá)。攝取進(jìn)入細(xì)胞后， mRNA 鏈需要與核糖體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)所編碼蛋白質(zhì)的翻譯表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)mRNA工程**改善mRNA 的蛋白質(zhì)合成速率和功能半衰期，mRNA疫苗中的mRNA鏈的典型元件示意圖如圖1所示。

圖1 體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) mRNA 的結(jié)構(gòu)元件。這些序列中的每一個(gè)部分都可以?xún)?yōu)化和修改，以調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯能力和免疫**能力。

有很多研究嘗試提高mRNA 分子的體內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯能力，同時(shí)避免不需要的先天免疫**。目前達(dá)成共識(shí)的是，這可以通過(guò)優(yōu)化 mRNA 的調(diào)控區(qū)域5' 帽、poly-A 尾和非翻譯區(qū) (UTR)來(lái)實(shí)現(xiàn)。UTR位于mRNA 編碼區(qū)的兩側(cè)，可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。

poly-A尾也能調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，因?yàn)樗目s短和去除都會(huì)導(dǎo)致 mRNA 的降解。5' 帽結(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和翻譯啟動(dòng)子的結(jié)合很重要。此外，具有**化 GC（鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶）含量的mRNA 結(jié)合密碼子優(yōu)化，即在編碼區(qū)選擇“常用密碼子”，可提高穩(wěn)定性和翻譯水平。

另一個(gè)關(guān)鍵因素是mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，它可以通過(guò)密碼子優(yōu)化和計(jì)算工具來(lái)改變一級(jí)序列使其穩(wěn)定。通過(guò)選擇“高度結(jié)構(gòu)化的編碼序列”在mRNA中構(gòu)建二級(jí)結(jié)構(gòu) （除了5' UTR 區(qū)域）也會(huì)產(chǎn)生更高的體內(nèi)翻譯水平，因?yàn)閙RNA體內(nèi)半衰期得到延長(zhǎng)?；蛘?，Mauger等人證明天然存在的修飾尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1Ψ）代替尿苷，會(huì)帶來(lái)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的整體變化，從而達(dá)到更高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。

重要的是，目前將RNA結(jié)合蛋白對(duì)mRNA的胞內(nèi)識(shí)別降至**的***方法是在mRNA中引入這些修飾的尿苷，這些蛋白參與對(duì)外來(lái)mRNA的先天免疫反應(yīng)，反過(guò)來(lái)增強(qiáng)了生物穩(wěn)定性和翻譯能力，同時(shí)降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外，還有跡象表明，m1Ψ 提高了mRNA 的堿基堆積和熔點(diǎn)，從而使mRNA更加穩(wěn)定。

這可能意味著 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的**疫苗，1mΨ的摻入也會(huì)提高給藥前mRNA 的穩(wěn)定性。*近有文章發(fā)表了對(duì) CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析，CureVac 采用了不同的策略。然而，即使優(yōu)化了mRNA的結(jié)構(gòu)，直接注射裸露的mRNA 也不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這可能是因?yàn)槁懵兜膍RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力差和對(duì)RNA酶（RNase）敏感。這說(shuō)明*優(yōu)化mRNA結(jié)構(gòu)不足以創(chuàng)建有效的 mRNA 疫苗，仍然需要額外的保護(hù)和遞送系統(tǒng)。

另一種類(lèi)型的 mRNA 疫苗SAMs不*編碼目標(biāo)抗原，還編碼RNA 聚合酶——來(lái)自病毒的“自我放大”因子。通常，SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸組成，而非自我復(fù)制的mRNA疫苗的序列長(zhǎng)度*為2-4 kb。開(kāi)發(fā) SAM 候選疫苗的目的是替代典型的兩劑策略的“啟動(dòng)-加強(qiáng)”方案，而是達(dá)到每位接種者單次注射。由于自帶的復(fù)制能力，SAM疫苗的注射劑量低于傳統(tǒng)mRNA疫苗，一劑便可能達(dá)到足夠保護(hù)效力。

當(dāng) SAM 在宿主細(xì)胞中被翻譯時(shí)，一種RNA聚合酶合成與編碼mRNA 模板互補(bǔ)的反義RNA中間體，再轉(zhuǎn)錄為許多編碼mRNA 分子，從而使抗原表達(dá)延長(zhǎng)和增強(qiáng)。目前兩種 SAM 疫苗都編碼完整的S 蛋白，并且這些疫苗在臨床試驗(yàn)中的**劑量比常規(guī)mRNA 疫苗的典型劑量低十倍以上。臨床開(kāi)發(fā)中的兩種SAM 疫苗是倫敦帝國(guó)理工學(xué)院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021，兩種疫苗均采用的是LNP包裹技術(shù)。

LNPs 作為遞送系統(tǒng)

為了克服裸露的mRNA轉(zhuǎn)染的種種問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了保護(hù)性遞送系統(tǒng)。目前的mRNA疫苗（表 1）都在使用 LNP 技術(shù)。這說(shuō)明了使用LNP能在穩(wěn)定mRNA 的同時(shí)并將其遞送到細(xì)胞中。mRNA疫苗中的LNP 由四種主要成分組成（見(jiàn)表1）：中性磷脂、膽固醇、聚乙二醇 (PEG) 脂質(zhì)和可電離脂質(zhì)?？呻婋x脂質(zhì)含有帶正電荷的可電離胺基團(tuán)（在低 pH 條件下電離），可在顆粒形成過(guò)程中與陰離子mRNA 相互作用，并在細(xì)胞攝取過(guò)程中促進(jìn)膜融合。此外，PEG化脂質(zhì)用于控制粒徑并充當(dāng)空間屏障起穩(wěn)定作用，防止儲(chǔ)存過(guò)程LNP微粒聚集。通過(guò)使用微流控混合生產(chǎn)技術(shù)，這些脂質(zhì)成分與 mRNA 一起形成大小約為 60-100 nm 的顆粒。例如，SARS-CoV-2 候選疫苗nCoVsaRNA和ARCoV的平均粒徑分別為75 nm和89 nm。

表一：

LNPs與脂質(zhì)體的不同之處在于微粒中存在脂質(zhì)，來(lái)自幾項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明水也存在于微粒內(nèi)部某些空間。這意味著mRNA即使被包封也可能暴露于水性環(huán)境中。這種類(lèi)型的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，先前已在未包載和包載siRNA的LNP中被冷凍電鏡所觀察到。類(lèi)似地，mRNA-LNPs 的冷凍電鏡結(jié)果也顯示了電子致密核，勞氏紫（Thionine）對(duì)RNA進(jìn)行染色用于冷凍電鏡對(duì)比度增強(qiáng)（見(jiàn)圖2）。

盡管mRNA-LNP 的共同特征是脂質(zhì)，但該的確切結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)脂質(zhì)成分（摩爾比）和 mRNA 定位的依賴(lài)性仍存在爭(zhēng)議（見(jiàn)圖3）。正如 RiboGreen檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所確定的那樣，mRNA 肯定位于 LNP 內(nèi)部。RiboGreen 是一種染料，當(dāng)與單鏈 mRNA 結(jié)合時(shí)會(huì)顯示熒光，但不能進(jìn)入 LNP。在 mRNA-LNP 制劑中，例如mRNA 疫苗的制劑，可與RiboGreen結(jié)合產(chǎn)生熒光的mRNA 比例非常低，因此，采用RiboGreen來(lái)測(cè)定的包封率通常 > 90%。綜上所述，冷凍電鏡（圖2) 和包封率證據(jù)表明，mRNA-LNPs形成納米粒子，其中包封了 mRNA，可免受外部介質(zhì)的影響，LNPs包封的mRNA的結(jié)構(gòu)有3種模型，這些主要來(lái)源于siRNA-LNPs分析（圖3）。

圖2 mRNA-LNP 的冷凍電鏡圖像顯示具有明顯不同電子密度的“囊泡”結(jié)構(gòu)

圖3 siRNA-LNP 和 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)的推測(cè)模型的示意圖 A：多層囊泡；B：納米結(jié)構(gòu)核；C：均質(zhì)核殼

mRNA疫苗所包封的mRNA會(huì)影響終LNP的結(jié)構(gòu)：siRNA 在結(jié)構(gòu)和分子量大小上與 mRNA 有很大不同（表 2）并且N/P（可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)與核苷酸磷酸鹽）摩爾比不同，N/P摩爾比分別為3和6（表 1）。mRNA 至少比 siRNA 大 100 倍，這會(huì)影響 LNP 的結(jié)構(gòu)。此外，有跡象表明 mRNA 位于 LNP 的核，而siRNA 更靠近表面，mRNA 可以形成“囊泡”（圖 2）。LNP 囊泡部分的組成是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題，在這種狀態(tài)時(shí)：“mRNA 可以從帶電的脂質(zhì)中解離，留在充滿(mǎn)溶劑的囊泡隔室中”。

表2  mRNA 和siRNA分子之間的差異

mRNA-LNP不太可能是（圖 3A）的多層囊泡模型。它與mRNA-LNP的 TEM結(jié)果中電子致密核位置不對(duì)應(yīng)。目前，大多數(shù)研究人員認(rèn)為 mRNA-LNP 貼近核殼模型（圖3 B和C），這意味著納米顆粒具有表面層和無(wú)定形的各向同性核。Viger-Gravel等，使用核磁共振光譜證明LNP結(jié)構(gòu)的兩種類(lèi)型的核是可能的。

他們描述了一個(gè)被陽(yáng)離子脂質(zhì)包圍（圖3B)的包含水孔的無(wú)定形核模型。他們還假設(shè)核中的脂質(zhì)可以均勻分散，中間有“小水球”（圖 3C）。后者（圖3B和C）跟siRNA-LNPs和mRNA-LNPs在實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果更吻合。

Arteta等人，使用冷凍電鏡、小角 X 射線散射 (SAXS) 和小角度中子散射 (SANS) 測(cè)量 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)模型。他們發(fā)現(xiàn)DSPC和PEG化脂質(zhì)以及部分可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)和膽固醇是位于LNP 的表面，可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇（取決于其濃度）、水和 mRNA 的主要部分分布在核內(nèi)部。有趣的是，他們的研究表明，各向同性LNP 核由24%（體積分?jǐn)?shù)）的水組成。他們指出 mRNA 位于水柱內(nèi)，水柱被陽(yáng)離子脂質(zhì)包圍（如圖4所示）。這意味著 mRNA 至少部分暴露于LNP 內(nèi)部的水中，這可能導(dǎo)致mRNA在非冷凍條件下儲(chǔ)存時(shí)不穩(wěn)定，Sebastiani等人也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果。

因此，研究 mRNA 如何與 LNP 中的水和可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)相互作用是一件很有趣的事。mRNA 是親水的，它可以通過(guò)靜電和氫鍵與可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)相互作用（通常表觀pKa < 6.5）。這取決于 LNP 內(nèi)部的pH值，如果 LNP 外殼對(duì)質(zhì)子具有滲透性——這很可能，因?yàn)?2-(對(duì)甲苯胺基)-6-萘磺酸 (TNS) 和勞氏紫等離子化染料可以進(jìn)入 LNP 核，那么LNP內(nèi)部的pH值與制劑的其余部分應(yīng)該相似，約為7 到 8，這意味著大多數(shù)可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)將不帶電。

然而，由于可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)堆積在核中，它們可能表現(xiàn)出聚電解質(zhì)行為，導(dǎo)致 Henderson-Hasselbalch 方程的偏差，即滴定曲線的“拖尾”（脂質(zhì)膜內(nèi)的可電離脂質(zhì)的表觀pKa可能與實(shí)際值有較大偏差，這意味著pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在脂質(zhì)膜內(nèi)的表觀pKa可能與理論值有1~2個(gè)pKa單位的偏差，所以pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在pH值為7-8之間的脂膜內(nèi)時(shí)，依然有可能絕大部分呈現(xiàn)帶正電的狀態(tài)，注：紅色斜體部分是對(duì)一些較復(fù)雜概念的進(jìn)一步解讀，后同）。此外，mRNA 和可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)之間的相互作用可能會(huì)影響電離行為。

對(duì)于 siRNA，發(fā)現(xiàn)與可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)存在較弱的靜電相互作用，這表明至少對(duì)于 siRNA-LNP 制劑，內(nèi)部的pH值接近或等于外部的pH值。對(duì)于 mRNA-LNP，尚未進(jìn)行此類(lèi)實(shí)驗(yàn)研究。mRNA 和陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究證明了脂質(zhì)-脂質(zhì)簇和脂質(zhì)-mRNA 簇的形成。靜電力和氫鍵都在驅(qū)動(dòng)陽(yáng)離子脂質(zhì)和 mRNA 的相互作用。

圖4 mRNA-LNPs核中mRNA-水柱的示意圖

Arteta 等人的另一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)是他們的mRNA-LNP 的外殼是單層的。其他研究人員根據(jù)冷凍電鏡（圖 2）或 SANS結(jié)果分析提出，mRNA-LNPs 的外殼由一個(gè)或多個(gè)雙層組成。這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)表明，使用這些技術(shù)評(píng)估m(xù)RNA-LNP 殼的性質(zhì)是困難的，可能存在多種類(lèi)型的mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)取決于脂質(zhì)的性質(zhì)和mRNA-LNP 的制備方法。反過(guò)來(lái)，不同的結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)不同配方的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響?？傊瑔?wèn)題仍然在于目前我們尚不清楚 mRNA-LNP 的結(jié)構(gòu)以及包封的mRNA 與各種脂質(zhì)成分之間的相互作用。

對(duì)各種 mRNA疫苗成分的分析表明，它們具有共同特征，但也存在差異（表 1）。LNP 配方、修飾核苷的使用、高GC含量以及常規(guī) mRNA 和 SAM 疫苗之間的長(zhǎng)度差異可能會(huì)影響這些 mRNA疫苗在儲(chǔ)存過(guò)程中的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。

mRNA疫苗的體外穩(wěn)定性

正如之前在背景介紹中提到的，目前已批準(zhǔn)的 mRNA疫苗流通的主要障礙之一是它們必須以冷凍形式儲(chǔ)存。在 2–8 °C 的溫度下，輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗分別可穩(wěn)定保存 5 天和 30 天，兩家公司都為終端使用提供了詳細(xì)的處理說(shuō)明。有趣的是，據(jù)報(bào)道 CureVac 的候選疫苗在冰箱溫度和 -60 °C 下可穩(wěn)定 3 個(gè)月。這些是目前發(fā)布了mRNA-LNP長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件的制造商，這種苛刻的溫度要求嚴(yán)重影響了這些疫苗的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和流通。然而，迄今為止，在公開(kāi)資料中幾乎沒(méi)有關(guān)于優(yōu)化mRNA 疫苗穩(wěn)定性的信息。本節(jié)旨在概述影響 mRNA-LNP 疫苗成分穩(wěn)定性的因素，并討論分析評(píng)價(jià)這種穩(wěn)定性的方法。

mRNA穩(wěn)定性

強(qiáng)烈影響所需儲(chǔ)存條件的主要因素是 mRNA 的穩(wěn)定性。如上文2.1 節(jié)所述，mRNA 分子的結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)可以用于增加體內(nèi)靶抗原的翻譯。mRNA 的特殊性在于，即使是長(zhǎng) mRNA 鏈（通常長(zhǎng)度在 1000 到 5000 個(gè)核苷酸之間）中的一個(gè)核苷酸發(fā)生變化（鏈斷裂或堿基氧化）便會(huì)導(dǎo)致翻譯終止。這使得 mRNA 疫苗與其他疫苗完全不同，在其他疫苗中，抗原的微小變化不一定對(duì)其功效產(chǎn)生顯影響。因此，對(duì)于 mRNA 疫苗，監(jiān)測(cè)整個(gè)分子的完整性是至關(guān)重要的。

mRNA 降解的方式有多種，可以分為化學(xué)和物理降解?；瘜W(xué)降解包括 mRNA 分子中化學(xué)鍵的改變。物理不穩(wěn)定性包括變性（二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失），與變性對(duì)蛋白質(zhì)生物制劑活性的影響不同，物理不穩(wěn)定性對(duì)mRNA的影響可能不太明顯。然而，變性還包括聚集和沉淀等變化，這些變化會(huì)影響mRNA的翻譯表達(dá)。在一篇關(guān)于核酸穩(wěn)定性的綜述中，Pogocki 和 Sch?neich 指出化學(xué)降解在siRNA降解中的影響比物理不穩(wěn)定性更大，對(duì)于鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的 mRNA來(lái)說(shuō)可能更是如此。

mRNA在體外的化學(xué)降解主要包括水解和氧化，水解主要是發(fā)生在mRNA 分子骨架的磷酸二酯鍵（圖5 ）。核糖上的2' OH 基團(tuán)起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)閷?dǎo)致 mRNA 鏈斷裂的酯交換反應(yīng)起始于磷酸酯鍵上的 2'OH 基團(tuán)的親核進(jìn)攻導(dǎo)致 P-O5' 酯鍵斷裂（圖5）。這個(gè)過(guò)程需要水，可以被核酸酶催化，也可以被 mRNA 分子本身和其他外源因素如酸和堿催化。在有關(guān) mRNA 水解的兩篇文獻(xiàn)中，作者指出 mRNA 的堿基序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響水解速率。具體而言，堿基堆積可能會(huì)降低磷酸二酯鍵的裂解速率，可以小化 mRNA 分子的“平均未配對(duì)概率”。可以使用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的算法來(lái)選擇可以形成大雙鏈區(qū)域的單鏈 mRNA 的核苷酸序列。據(jù)稱(chēng)，采用這種方法優(yōu)化后，體外穩(wěn)定性得到了改善。

CureVac、輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗之間的區(qū)別在于后兩者具有 1-甲基-假尿苷的單核苷摻入。之前的一項(xiàng)研究表明，這種修飾提高了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。CureVac 采用提高GC比例策略，具有類(lèi)似的效果。

圖5 通過(guò) 2',3'-環(huán)狀磷酸酯，堿基催化RNA分子內(nèi)的磷酸二酯鍵水解、B表示Br?nsted堿。

相反，氧化會(huì)影響堿基，并在較小程度上影響mRNA 核糖單位的糖基團(tuán)。氧化可導(dǎo)致堿基裂解、鏈斷裂和 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。然而，如前所述，水解似乎被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng) mRNA 降解的關(guān)鍵因素。

LNP穩(wěn)定性

除了mRNA 的完整性外，LNP 的穩(wěn)定性對(duì)于 mRNA-LNP 疫苗的質(zhì)量也至關(guān)重要。目前的mRNA疫苗沒(méi)有披露關(guān)于LNP 穩(wěn)定性測(cè)試的數(shù)據(jù)，但 Onpattro (patisaran) 的siRNA-LNP 制劑保存在2~8°C 之間時(shí)具有三年的有效期，同時(shí)該產(chǎn)品不能冷凍保存。

Onpattro 的LNP 系統(tǒng)的組成是：可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇、PEG2000-C-DMG（見(jiàn)表 1）（摩爾比 50:10:38.5:1.5），它們?cè)诮M成上類(lèi)似于 Comirnaty 和 mRNA-1273的LNP。在一項(xiàng)siRNA-LNPs 的研究中用類(lèi)脂質(zhì)306O 13代替DLin-MC3-DMA，樣品水溶液在 2°C 、pH 7 的環(huán)境下下能穩(wěn)定儲(chǔ)存156 天，其粒徑和siRNA包封率沒(méi)有明顯變化。Suzuki 等人的補(bǔ)充研究表明 siRNA-LNP 能在 4°C 環(huán)境下穩(wěn)定儲(chǔ)存1.5?？傊?，這些數(shù)據(jù)都表明是mRNA 的不穩(wěn)定，而不是 LNP 的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了當(dāng)前mRNA-LNP疫苗的儲(chǔ)存條件嚴(yán)苛和保質(zhì)期短。

Fan等人總結(jié)了脂質(zhì)體和 LNP的穩(wěn)定性及其質(zhì)量屬性。LNP 可以承受化學(xué)和物理不穩(wěn)定性，化學(xué)不穩(wěn)定性包括 LNP 中易水解和氧化的脂質(zhì)的降解。脂質(zhì)氧化可能發(fā)生在不飽和脂肪酸部分（Comirnaty 和 mRNA-1273 不存在該問(wèn)題）和膽固醇，氧化可能是PEG2000 -DMG中PEG基團(tuán)存在雜質(zhì)導(dǎo)致的結(jié)果。除此之外，氧化性雜質(zhì)也可能導(dǎo)致包封的mRNA 氧化。脂質(zhì)例如 DSPC 和可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)中的羧酸酯鍵容易受溫度和pH依賴(lài)性的水解的影響（圖 6）。

LNP 穩(wěn)定性的另一個(gè)關(guān)鍵因素是物理穩(wěn)定性，主要有三種類(lèi)型的物理不穩(wěn)定性：包封的藥物的聚集、融合和泄漏。 LNP 在儲(chǔ)存和流通過(guò)程中容易發(fā)生 LNP 的聚集，所以為了增加穩(wěn)定性，LNP 中通常添加PEG化脂質(zhì)，LNP微粒表面的PEG 分子可防止LNP 聚集。

另一種類(lèi)型的物理不穩(wěn)定性主要由于mRNA 的泄漏，這主要影響包封產(chǎn)品的穩(wěn)定性。值得注意的是，包封率通常 > 90%，并且尚未報(bào)道過(guò)在儲(chǔ)存期間出現(xiàn)mRNA泄露（用RiboGreen監(jiān)測(cè)）的情況。未包封的mRNA（“裸露的mRNA”）幾乎不會(huì)被細(xì)胞攝??；而且它會(huì)迅速被降解，因此無(wú)法用于翻譯。

圖6 用于 mRNA-LNP疫苗BNT162b2 (Comirnaty) 和 mRNA-1273的脂質(zhì)。

由于注射 mRNA-LNP疫苗時(shí)的超敏反應(yīng)可能與PEG化脂質(zhì)有關(guān)，因此，已經(jīng)研究了防止聚集體形成的替代脂質(zhì)。使用多聚肌氨酸修飾脂質(zhì)能使脂質(zhì)遞送系統(tǒng)更加穩(wěn)定，在防止LNP聚集的同時(shí)能夠減少超敏反應(yīng)。但是目前仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定這種 PEG化脂質(zhì)替代品是否能真正的提高 mRNA 的穩(wěn)定性（例如不含過(guò)氧化物，注：目前使用的PEG脂質(zhì)由于工藝原因，會(huì)有一定的過(guò)氧化物雜質(zhì)，這會(huì)引起LNP中其他含有不飽和鍵的脂質(zhì)和mRNA的氧化降解）。

分析 LNP 穩(wěn)定性

Fan 等人在前面提到的文章中對(duì)監(jiān)測(cè) LNP 穩(wěn)定性的分析方法進(jìn)行了專(zhuān)業(yè)評(píng)估。我們推薦感興趣的讀者可以查看相關(guān)文獻(xiàn)。

mRNA-LNP中哪個(gè)成分更不穩(wěn)定？

迄今為止，已有幾項(xiàng)研究考察了在儲(chǔ)存期間穩(wěn)定 mRNA 和穩(wěn)定 LNP 的方法。然而，兩者之中哪一個(gè)才是mRNA-LNP穩(wěn)定性的瓶頸？當(dāng)mRNA-LNP 制劑未冷凍時(shí)，是mRNA 降解？還是 LNP 降解導(dǎo)致穩(wěn)定性問(wèn)題？還是 mRNA 與 LNP 的組合？

與mRNA-LNP 系統(tǒng)相比，包封化學(xué)修飾且高度穩(wěn)定的siRNA 分子（例如 Onpattro）的LNP系統(tǒng)具有更長(zhǎng)的有效期。這表明當(dāng)前的穩(wěn)定性瓶頸不是 LNP，而是 mRNA。

迄今為止，公開(kāi)資料還沒(méi)有披露關(guān)于 mRNA-LNP 制劑中 mRNA 和 LNP 完整性的研究報(bào)告。在研究存儲(chǔ)效果的少數(shù)研究中，例如 Zhang等人的研究，并沒(méi)有考察長(zhǎng)期儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。因此，我們將首先研究裸露的mRNA的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，但需要注意的是，這可能與包封在 LNP中的 mRNA 的穩(wěn)定性有所不同（見(jiàn)下文）。

在Pascolo等人的綜述中，裸露的mRNA的水溶液在無(wú)RNase的情況下只能在4°C下儲(chǔ)存幾天。這似乎符合目前對(duì) mRNA 不穩(wěn)定性的看法。目前關(guān)于裸露的mRNA長(zhǎng)期穩(wěn)定性的研究表明，mRNA 需要冷凍或干燥才能保持更長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定。

Roesler等人2009年的研究表明，編碼熒光素酶的mRNA 在無(wú)RNA酶存在的條件下，分別以液體或凍干形式在室溫下儲(chǔ)存，表達(dá)效率分別在第8天和第16天開(kāi)始出現(xiàn)降低，凍干輔料和凍干工藝方面未經(jīng)優(yōu)化（見(jiàn)圖 7）。同時(shí)本研究無(wú)法得出關(guān)于2-8℃溫度下長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的結(jié)論，因?yàn)榉€(wěn)定性研究只考察了32 天。

Wayment-Steele等人經(jīng)過(guò)基于理論降解速率計(jì)算，預(yù)測(cè) 長(zhǎng)度為4000 nt的mRNA在 pH 7.4 和5 °C 的條件下，存儲(chǔ)的半衰期為 941 天。他們注意到較長(zhǎng)的mRNA序列，例如SAM，更容易發(fā)生水解。由于這是jin基于水解降解動(dòng)力學(xué)的理論計(jì)算結(jié)果，可能會(huì)低估 了mRNA的實(shí)際降解速率，例如，當(dāng)存在痕量RNase時(shí)，必須對(duì) mRNA 的穩(wěn)定性進(jìn)行更多研究才能知道m(xù)RNA實(shí)際存儲(chǔ)的穩(wěn)定性情況。

圖7 通過(guò)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)效率分析mRNA在水中的穩(wěn)定性

這些研究表明，在水溶液中 mRNA 可能不如 LNP 穩(wěn)定。然而，應(yīng)該重申的是，這兩種成分的穩(wěn)定性考察結(jié)果可能與LNP包封mRNA 的情況不同。如前幾節(jié)所述，mRNA 與可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇和水一起位于 LNP 核內(nèi)部（參見(jiàn)圖 4）。這意味著 mRNA 處于水性環(huán)境中，因此容易發(fā)生水解，其水解的機(jī)制可能與溶液中 mRNA水解 的機(jī)制相似。然而，另一方面，LNP 內(nèi)的 mRNA 可能通過(guò)疏水、氫鍵和/或靜電相互作用被可電離的脂質(zhì)包裹。在這種情況下，mRNA 可能比溶解在水溶液中的裸露的mRNA更穩(wěn)定。在沒(méi)有進(jìn)一步研究的情況下，只能得出結(jié)論，mRNA 的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了儲(chǔ)存條件苛刻。 

儲(chǔ)存條件不同的原因

當(dāng)前 mRNA 疫苗的另一個(gè)有趣方面是，不同廠家疫苗報(bào)告的儲(chǔ)存溫度和相應(yīng)的“有效期”差異很大：從 -80°C 到 2-8°C，從幾天到幾個(gè)月。是否因?yàn)閙RNA 疫苗處的不同導(dǎo)致這種儲(chǔ)存條件的差異？又或者，儲(chǔ)存條件的差異是否與熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果相關(guān)或更可靠的方法有關(guān)？這些信息很重要，因?yàn)樯钊肓私鈱?duì)穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響的因素可能是未來(lái)設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定mRNA 疫苗的關(guān)鍵突破點(diǎn)。

Acuitas Therapeutics的首席執(zhí)行官Tom  Madden 曾經(jīng)在采訪中表示，Moderna 和 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗可能具有相同的穩(wěn)定性。后者是否有可能使用更保守的方法來(lái)確保穩(wěn)定性？盡管如此，目前必須在 -60 至 -80 °C 之間儲(chǔ)存的Pfizer/BioNTech mRNA-LNP 疫苗很可能也在更高的溫度和冷藏條件下進(jìn)行了穩(wěn)定性考察，正如CureVac 科學(xué)家所做的那樣。

此外，穩(wěn)定性測(cè)試中的分析技術(shù)在靈敏度上可能不同，驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)也可能不同。疫苗穩(wěn)定性研究報(bào)告的發(fā)布可能對(duì)這些疑問(wèn)作出回答，對(duì)此進(jìn)行比較研究會(huì)是很有趣的工作。

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